质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）是一种无需标记、可保留空间信息的分子可视化技术，广泛用于疾病机制、药物开发、食品安全和材料表征等领域。然而，实现可靠的原位非靶向代谢物鉴定始终是核心挑战：全扫描 MS1 仅能靠精确分子量匹配注释化合物，无法区分同分异构体；串联质谱（MS2）虽能提供结构信息，但传统数据依赖采集（DDA）需牺牲空间分辨率或成倍延长分析时间，且偏向高丰度物质。

针对这一矛盾，中国科学院成都生物研究所的周燕团队提出聚类重采样质谱成像（CR-MSI）。其核心思想是将原位 MS2 采集从逐像素扫描转化为少数代表性位点检测：先通过全扫描 MSI 获取 MS1 数据，探索空间化学异质性；再利用液相微萃取在异质性指导下对各亚区表面萃取，通过链式电喷雾电离（chain-ESI）进行非靶向 MS2 采集。链式 ESI 可在皮升每分钟量级超低流速下稳定电离，适合从单个成像像素获取大量 MS2 谱图。此外还开发了集成自动化装置和基于 Python 的多进程数据处理软件，将大鼠冠状切片的总采集与处理时间缩短至约 2.2 小时。配套的自动多步连续聚类（Auto-MSCC）算法可迭代细分主导聚类，自动将粗特征区域划分为化学均一亚区并推荐 LESA 采样点，使 MS2 采集从依赖经验转变为数据驱动。在大鼠脑切片中，CR-MSI 采集到上千个原位 MS2，其中 unique MS2 较传统 DDA-MSI 提升 410%，并鉴定了 819 个内源代谢物，MS2 覆盖度甚至超过全组织提取液的LC-MS/MS。牛磺酸、亚精胺/精胺及多种磷脂呈现出清晰的区域特异性分布，表明该方法能在保留空间信息的同时提供可靠的原位结构鉴定。

总体而言，CR-MSI 代表原位 MS2 采集的创新转变——从逐像素网格采集转向化学异质性引导的代表性位点快速分析，展现出快速、高效、非靶向的原位代谢物鉴定能力，并可兼容 DESI、MALDI、nanoESI、 pulsed-DC ESI、InESI 等多种 MSI 与 LESA 电离平台，为空间代谢组学、药物发现和疾病机制研究提供了新的通用思路。

相关成果以“InSitu Untargeted Metabolite Identification and Spatial Mapping by Clustering Resampling Mass Spectrometry Imaging”为题发表在Analytical Chemistry上。中国科学院成都生物研究所博士后王宇为论文第一作者，周燕研究员、夏兵正高级工程师为共同通讯作者。研究得到国家自然科学基金、四川省自然科学基金，四川省重点研发计划，成都生物研究所青年探索项目，成都生物研究所前沿交叉项目等项目资助。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c02449

图1. 聚类重采样质谱成像技术的原理示例图

图2. 聚类重采样质谱成像技术MS2分析能力和其他MS2分析方法的对比

图3. 连续多步分析识别样品的化学异质性特征

图4. 质谱成像数据扫描与实时同步数据处理

图5. 聚类重采样质谱成像技术分析大鼠脑中代谢分子的空间分布特征与同步原位代谢分子注释